热点文章汪涛自体造血干细胞移植HSC

汪涛

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主医院集团心脏血管中心主任学术任职1、国家心血管病专家委员会血管外科分会委员...

　　糖尿病足是导致糖尿病患者致残致死的严重慢性并发症之一。世界卫生组织对糖尿病足的定义是糖尿病患者由于合并神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和/或深部组织的破坏。据报道，全球约1.5亿糖尿病患者中15％以上将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽。因糖尿病足造成截肢者是非糖尿病患者的15倍，每年的截肢患者中约50％是糖尿病患者，而后者85％以上是因足部溃疡恶化造成深部感染或坏疽所致。有数据表明，我国糖尿病患者多达万，大约四分之一的病人患有糖尿病足。发现和治疗比较晚的患者常常合并广泛的感染，截肢率和死亡率高。

　　糖尿病足的传统治疗手段包括药物、血管搭桥和介入手术等保守治疗，效果不佳，而临床中，至少有30％~40％糖尿病足患者因下肢微循环差、小血管完全闭塞，无法使外科血管重建手术而不得不接受截肢手术。此外，由于糖尿病足患者多因年老体弱，或心肺功能差、基础疾病多而不能接受手术治疗。因此，开辟新的治疗途径是必然趋势。干细胞移植治疗糖尿病足是近年出现的新方法，发展迅速并已应用于临床。根据干细胞的不同来源，目前临床上自体干细胞移植治疗糖尿病足的方式主要有自体骨髓干细胞移植和自体外周血干细胞移植。骨髓干细胞移植是较早开展的方法，但由于采髓量大，对于年老体弱的患者来说，可能无法耐受而放弃治疗；而自体外周血干细胞移植具有采集的干细胞数量相对较多、患者痛苦小、移植后恢复快的优点。

　　自体外周血干细胞即CD34+造血干细胞（HematopoieticStemCell，HSC）移植治疗糖尿病足是根据HSC在诱导作用下可以分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，分泌大量的促血管生成因子，促进新生血管形成的原理，将患者自体的外周血CD34+HSC分离出来并进行扩增，移植到缺血的下肢部位，使其逐渐分化并形成新的毛细血管，改善和恢复下肢血流，再经过3~6个月的恢复期，新生血管便可长成，达到治疗糖尿病足的目的。由于HSC取自自体，因此没有免疫排斥反应，保证了临床应用的安全性。

　　自体HSC移植作为治疗糖尿病足的一项新技术，已在国内外广泛应用并取得了成功，可使一部分患者免除截肢或降低截肢平面，改善患者的生活质量；在动物实验和临床试验中，自体HSC移植短期内均未出现明显不良反应和严重后果，说明自体HSC移植治疗糖尿病足在临床上是具有可行性和安全性的。但目前临床上应用于移植的自体HSC存在纯度不高及数量较少的缺陷，一定程度上限制了其治疗糖尿病足的临床疗效。因此，在本课题中，我们通过对自体HSC的体外高效分离、纯化和扩增培养技术进行研究，期望能获得具有高纯度、高增殖活性的自体HSC，以促进自体HSC移植治疗糖尿病足的临床应用，进一步提高其临床疗效，改善患者生活质量，从而造福广大患者，具有较强的临床应用价值。

　　糖尿病足的主要发病原因是下肢供血障碍，且主要为流出道闭塞，故药物治疗、血管搭桥、介入手术等疗效欠佳。而自体HSC移植治疗糖尿病足，可促进局部血管形成，疗效明显。采用传统方法获取的自体HSC纯度不高，且细胞数量有限，限制了其移植治疗糖尿病足患者的临床疗效。因此，开发出一种可高效分离、纯化并能大规模扩增自体HSC的技术，对于提高其临床疗效尤为重要。

1）CD34+HSC的分离纯化技术

　　正常状态下，干细胞主要存在于骨髓中，外周血的干细胞数量仅为骨髓中的0.1％~1％，CD34+细胞仅占外周血单个核细胞的0.01％~0.1％。由于外周血干细胞在正常生理情况下含量稀少，目前临床上需要应用外周血干细胞动员剂并进行分离和纯化。G-CSF（重组人粒细胞集落刺激因子）不仅能促进粒系造血祖细胞的增殖，分化，还可有效地动员骨髓中的HSC，使其大量释放到外周血中。在自体干细胞移植的干细胞动员期间，国内外大多数研究组均常规应用5~10μg/(kg?d)的G-CSF进行骨髓动员将骨髓中的干细胞动员到外周血液循环中，5天后通过专用的单个核细胞分离机，将含有HSC的单个核细胞分离出来，进行移植。一般给予G-CSF四到五天后,其外周血中CD34+细胞数可达到动员前40~80倍,停用1周后外周血中CD34+细胞数可逐步恢复至用药前水平。这种经过骨髓动员后采集外周血单个核细胞进行移植的方法存在一定的缺陷，首先，移植到患者体内的细胞不是纯化的CD34+HSC，还包含其它多种类型的单个核细胞，CD34阳性率仅有0.5％~2％，限制了治疗的有效性；其次，长时间的骨髓动员会使大量有核细胞进入血循环，导致血液黏稠度增加，血管内血栓形成的机会增加，增加心肌梗死和脑梗死发生的危险。因此有必要寻找一种更安全的CD34+HSC的分离、纯化的方法，以提高其临床移植治疗糖尿病足的安全性和有效性。

2）CD34+HSC的基因修饰与体外扩增培养

　　血管细胞黏附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)又被称为CD，属于免疫球蛋白超家族，是重要的黏附分子。VCAM-1广泛分布在造血和非造血细胞表面，包括内皮细胞、骨髓基质细胞及成纤维细胞等，其受体是极迟抗原-4(verylateantigen-4，VLA-4)，又称整合素(α4β1)。VCAM-1可介导造血细胞与组织之间的黏附和信息交换，增强造血细胞对细胞因子反应的敏感性，参与机体造血的调控。有大量研究表明，VCAM-1及其受体在造血干细胞动员和归巢中发挥着重要的调节作用，其调节作用是通过影响信号通路来实现的。韩忠朝教授的最新研究进一步显示，VCAM-1+间充质干细胞具有良好的促血管生成活性，将VCAM-1+间充质干细胞输注到BALB/c裸鼠的缺血后肢，其下肢功能显著改善，证明了VCAM-1+间充质干细胞具有良好的旁分泌促血管生成效果，可作为相关疾病的重要治疗手段。因此，本项目拟通过基因修饰的方法提高VCAM-1在CD34+HSC表面的表达水平，以促进CD34+HSC的粘附能力和促血管生成能力。

　　细胞因子支持的体外扩增是目前造血干/祖细胞体外扩增应用最广泛的方法。依据细胞因子针对HSC生长周期发育阶段的不同，可分为三类：第一类因子主要调节HSC从G0期向G1期发育，如干细胞因子（stemcellfactor，SCF）、fms样酪氨酸激酶3（fms-liketyrosinekinase3,FLT3）、血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、MP1等；第二类因子可抑制HSC进入G0期，如转化生长因子-β（transforminggrowthfactorβ，TGF-β），MIP-1α、p38等；第三类因子主要促进S期HSC扩增，如胰岛素生长因子2（insulingrowthfactor2，IGF-2）、白介素3（interleukin3，IL-3）、白介素6（interleukin6，IL-6）、Notch配体等。目前应用最为广泛，效果最为确切的细胞因子主要包括SCF、TPO、FLT3。SCF为间充质干细胞分泌的糖蛋白，大量实验表明应用SCF进行HSC体外培养可有效减少细胞凋亡，发挥增殖刺激作用，而缺乏SCF时HSC的体外扩增效率明显下降。TPO是一种调节巨核细胞谱系发育及血小板生成的特异性细胞因子。近年研究表明，TPO在调节HSC增殖分化方面发挥重要作用：一方面可通过延长HSC细胞周期维持其稳定性，另一方面也可促进HSC产生及扩增，并可促进HSC及祖细胞的迁徙及归巢。FLT3为表达于HSC及早期祖细胞表面的Ⅲ型酪氨酸激酶受体家族成员之一。体内及体外研究均表明FLT3与其配体FLT3-L结合可影响造血祖细胞和干细胞生长、分化及凋亡，可显著提高HSC体外培养扩增效率。但是，以SCF+TPO+FLT3为基础的常用因子组合在扩增HSC的同时伴有分化现象，不仅限制HSC的扩增效率，还影响HSC移植后在体内的长期重建功能。

　　一项最新研究表明，一种新型嘧啶吲哚类小分子化合物UM可在体外有效促进人CD34+HSC的扩增，长时程观察显示UM支持长期再生HSC（LT-HSC）扩增，而应用UM培养的HSC进行的移植实验显示UM对LT-HSC作用确切，研究显示UM并非通过AhR通路发挥作用，但其机制目前尚不明确，可能与抑制红系和巨核细胞分化基因相关。基于目前CD34+HSC体外扩增培养技术的现状，本项目的另一个研究重点就是开发出一种可长期维持HSC自我更新能力的最佳因子组合，以大大提高HSC的增殖能力，抑制分化。

3）自体HSC移植治疗糖尿病足的临床应用

　　自体HSC移植作为治疗糖尿病足的一项新技术，已在国内外广泛应用并取得了成功。Kawamura等采用自体外周血单核干细胞移植治疗30例因糖尿病或闭塞性动脉硬化所致的下肢溃疡，其中21例症状明显改善，包括肢体末梢温度和疼痛明显好转。蒋锐等对12例重度糖尿病足患者进行外周血HSC移植治疗，对照组采用一般治疗，3个月后治疗组患者疼痛缓解率、冷感缓解率、间歇性跛行缓解率、溃疡愈合率均大于对照组，差异有统计学意义。治疗组3个月后踝肱指数(ABI)与治疗前比较有显著差异，对照组则无统计学差异。侧支血管形成数量：治疗组分别可见1、2、3级新生血管形成，对照组无明显新生血管形成。胡国平等观察进行自体外周血干细胞移植的糖尿病足患者移植前后均未出现不良反应，并且随着时间延长患者症状改善明显，足部溃疡面逐渐愈合，RBP4(视黄醇结合蛋白4)水平也逐渐下降(P0.01)。姚秀宇等在对糖尿病足患者进行干细胞移植后，患者症状明显好转的同时，其胰岛素用量明显降低，说明干细胞在糖尿病患者体内可以部分分化为胰岛β细胞。因此，自体HSC移植治疗糖尿病足在临床上是具有可行性和安全性的。

作者：刘韬汪涛